^۱محاسبه انرژی از روی منبع NRC 1993 که برای میزان پروتئین، چربی و کربوهیدرات جیره بترتیب مقادیر ۶۴/۵، ۴۳/۹ و ۱۱/۴ لحاظ شده است.

^۲محاسبه انرژی قابل هضم نیز از روی هضم پذیری ظاهری که برای پروتئین، چربی و کربوهیدرات جیره بترتیب مقادیر ۹/۰، ۸۵/۰ و ۸/۰ لحاظ شده است (NRC 1993).
۲-۲- تهیه و ذخیره سازی ماهیان
برای تهیه ماهیان تعداد ۱۲۰۰ قطعه قزل آلای رنگین کمان با میانگین وزنی ۱±۱۵ گرم از یکی از مراکز تکثیر و پرورش شهرستان ارومیه خریداری شده و با تانکر مخصوص حمل بچه ماهی مجهز به هواده به سالن تکثیر و پرورش پژوهشکده آرتمیا و جانوران آبزی دانشگاه ارومیه منتقل شدند. پس از گذراندن ده روز دوره آداپتاسیون و ضد عفونی با محلول نمک PPT 30 در قالب هشت تیمار (هر تیمار دارای سه تکرار) در ۲۴ تانک ۳۰۰ لیتری (حاوی ۲۰۰ لیتر آب) که قبلاً با مواد ضد عفونی کننده کاملاً ضدعفونی شده بودند با تراکم ۵۰ قطعه در هر تانک ذخیره سازی شدند (شکل ۱-۲).

شکل ۱-۲: مربوط به تانکها و محیط پرورشی ماهیان
۳-۲- زیست سنجی ماهیان (بیومتری) :
به منظور آگاهی از عملکرد جیره های غذایی و روند رشد ماهی ها در روزهای صفر، ۳۰ و ۶۱ نسبت به بیومتری آنها اقدام گردید. جهت بیومتری ماهیان، از یک ترازوی دیجیتال با دقت ۰۰۱/۰ گرم برای اندازه گیری وزن و از یک خط کش میلیمتری برای اندازه گیری طول کل استفاده گردید. اطلاعات حاصل از بیومتری در هر مرحله به منظور انجام آنالیزهای آماری ثبت و بر اساس آن، مقدار غذای ماهی ها تا بیومتری بعدی تعیین گردید.
برای این منظور فاکتورهای وزن Weight با دقت یک دهم گرم، طول کل Total length با دقّت یک میلیمتر اندازه گیری شده و بر همین اساس فاکتورهایی نظیر درصد افزایش رشد Growth Rate، ضریب‌رشد روزانه specific growth rate، ضریب چاقی Condition factor، ضریب رشد روزانه Daily Growth Coefficient، ضریب تبدیل غذایی Feed conversion ratio، ضریب بازده غذایی Feed efficiency ratio، شاخص تبدیل غذایی Feed conversion index، درصد افزایش وزن percentage weight gain، نرخ کارآیی پروتئین Protein efficiency ratio، ارزش تولیدی پروتئینProtein productive value، نرخ کارآیی چربی Lipid efficiency ratio، ارزش تولیدی چربی Lipid productive value، ضریب هضم پذیری ظاهری چربی و پروتئین Apparent nutrient digestibility، شاخص هپاتوسوماتیک hepatosomatic index مورد اندازه ­گیری قرار گرفت.
۴-۲- نمونه برداری از ماهیان جهت آنالیز شیمیایی :
برای آنالیز شیمیایی عضله ماهیان، در پایان دوره تعداد ۳ عدد ماهی از هر تکرار به طور تصادفی صید و تا زمان انجام آنالیز شیمیایی در فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
۵-۲- آنالیز شیمیایی نمونه های غذایی و بافت عضله ماهیان :
برای تعیین درصد پروتئین، رطوبت و خاکستر از روش استاندارد ( AOAC, 1990) مطابق روش های زیر صورت پذیرفت.
۱-۵-۲- تعیین میزان پروتئین :
برای اندازه گیری میزان پروتئین موجود در نمونه ها از دستگاه میکرو کلدال اتوماتیک ۲۳۰۰ ساخت شرکت Foss استفاده گردید. روش بکار رفته با بهره گرفتن از این دستگاه برای اولین بار در سال ۱۸۸۳ میلادی توسط ” Kjeldahl” در دانمارک به کار گرفته شد و به عنوان یک روش اصلی در تعیین ازت و پروتئین مواد غذایی استفاده می شود.
برای تعیین درصد پروتئین موجود در نمونه ها، ۱ گرم از نمونه های خشک پودر شده درون لوله های آزمایش مخصوص هضم ریخته شد و به هر لوله حدود ۲۰ میلی لیتر اسید سولفوریک ۱/۰ نرمال، یک عدد قرص هضم حاوی سولفات مس یا سولفات پتاسیم و چند قطره اُکتان نرمال به عنوان ضد کف اضافه شد. یک لوله نیز به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. پس از رسیدن درجه حرارت کوره هضم به حدود ۴۲۰ درجه سانتی گراد، لوله ها در داخل آن قرار داده شدند تا هضم صورت پذیرد. در هنگام هضم، نمونه ها ابتدا به رنگ قهوه ای ، سپس به رنگ زرد شفاف و در مرحله آخر، تقریباً به رنگ آبی شفاف درآمدند که این نشانه هضم آنها بود. این مراحل حدود ۲ ساعت به طول انجامید. و در قسمت تیتراسیون دستگاه کلدال که تمام اتوماتیک است، قرار داده شد. به این دستگاه سه ظرف حاوی اسید بوریک ۱/۰ نرمال، سود ۴۰% و آب مقطر متصل هستند که با نسبت مشخصی از هر کدام توسط دستگاه برداشته می شود. بعد از مرحله تقطیر مرحله تیتراسیون می باشد که محلول را با اسید سولفوریک ۱/۰ نرمال تیتر می کنیم تا pH محلول به ۸/۴ برسد سپس میزان اسید مصرفی را ثبت میکنیم. و بر اساس فورمول زیر میزان پروتئین محاسبه می گردد. (AOAC, 1990; Ceirwyn, 1995)
محاسبه میزان پروتئین بافت عضله ماهیان = میزان اسید مصرفی × ۲۵/۶ ×۲۸/۰
۲-۵-۲- تعیین میزان چربی کل
برای تعیین درصد چربی کل نمونه ها، ابتدا ۱ گرم وزن خشک از نمونه ها وزن کرده و در داخل لوله های شیشه ای در پیج دار میریزیم و سپس cc 10 اتر روی آن ریخته و در لوله ها را محکم می بندیم و به مدت ۱۲ ساعت در دمای ۴۰ درجه سانتیگراد داخل اوون قرار میدهیم. در جند ساعت اول نمونه ها تکان داده و درب آنها را محکم میبندیم. سپس لوله آزمایش دبگری را وزن کرده و بعد ۱۲ ساعت محلول اتر را با پیپت پاستور به آرامی برداشته و داخل لوله آزمایش دوم میریزیم. این کار را دوباره تکرار میکنیم. سپس لوله آزمایش دوم را که حاوی چربی محلول در اتر میباشد در داخل اوون به مدت ۱۲ ساعت در دمای ۴۰ درجه سانتی گراد قرار میدهیم که اتر آن تبخیر شده و چربی بر جای بماند. و میزان چربی کل را او فورمول پایین محاسبه می نماییم.
W= (G₁-T) / ( (وزن نمونه ×۱۰۰
وزن ظرف با چربی=G₁
وزن ظرف
خالی= T
۲-۵-۲- تعیین میزان رطوبت
برای تعیین درصد رطوبت نمونه ها، ابتدا وزن ظرف خالی مخصوص اندازه گیری رطوبت تعیین شد. سپس، مقدار ۱۰-۵ گرم از هر نمونه داخل آن ریخته شد. وزن نمونه ها قبل از خشک کردن تعیین گردید. پس از این مرحله، نمونه ها در اوون مدل SIC08 H ساخت شرکت Ecotee به مدت ۲۴ ساعت در درجه حرارت ۶۰ درجه سانتی گراد خشک شدند (Benijts et al., 1975). پس از اتمام این مرحله و سرد شدن ظروف حاوی نمونه در دسیکاتور، نمونه ها وزن شدند. برای دقّت بیشتر، وزن کردن ۳ بار تکرار و از داده های به دست آمده میانگین گرفته شد. در نهایت، با محاسبه اختلاف وزن نمونه ها در حالت های تر و خشک، درصد رطوبت نمونه ها با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه گردید ( AOAC, 1990)
W=(G₁-G₂) /(G₁-T) ×۱۰۰
وزن ظرف با نمونه تر=G₁
وزن ظرف با نمونه خشک=G₂
وزن ظرف خالی= T
۳-۵-۲- تعیین میزان خاکستر
برای تعیین میزان خاکستر نمونه ها از کوره الکتریکی (Muffle Furnance) ساخت شرکت ایران خودساز استفاده شد. نمونه های خشک شده پودری درون بوته چینی ریخته و به مدت چهار ساعت در دمای ۵۰۰ تا ۵۵۰ درجه سانتیگراد سوزانده شد. قبل از آن بوته های چینی به مدت ۴۵ دقیقه داخل کوره قرار داده شدند تا سرد شوند. سپس، نمونه ها با ترازوی دیجیتال مدل OHAUS با دقت ۰۰۰۱/۰ گرم وزن شدند. برای دقت بیشتر این کار ۳ بار تکرار شد ( AOAC , 1990). درصد خاکستر نمونه ها از طریق فرمول زیر محاسبه گردید:
= (E-B) / ( D-B) ×۱۰۰ درصد خاکستر
وزن ظرف با خاکستر= E
وزن ظرف با نمونه خشک =D
وزن ظرف خالی=B
۴-۵-۲- تعیین میزان کربوهیدرات
برای محاسبه میزان کربوهیدرات در درصد ماده خشک از فورمول زیر محاسبه میگردد (Aksnes et al ۲۰۰۶) :
(پروتئین+چربی+رطوبت+خاکستر)- ۱۰۰= کربوهیدرات (درصد)
۵-۵-۲- تعیین ترکیب و میزان اسیدهای چرب
برای آنالیز نمونه ها جهت تعیین میزان اسیدهای چرب موجود در آنها، از دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC) مدل Agilent 7890A ساخت کشور امریکا استفاده گردید. نمونه ها را می توان به صورت خشک شده و یا به صورت تر برای آنالیز استفاده کرد.
مراحل آماده سازی نمونه ها به شرح زیر بودند:
الف) از هر نمونه مقدار تقریبی ۵/۰ گرم وزن تر به لوله های ۳۵ میلی لیتری درب دار منتقل شد.
ب) مقدار ۵ میلی لیتر ترکیب اتانول و تولوئن به نسبت حجمی ( ((v/v 3:2 اتانول : تولوئن) و سپس ۱۰۰ میکرولیتر محلول استاندارد داخلی (حاوی اسید چرب ۶-n2: 22 حل شده در ایزواکتان) به هر نمونه موجود در لوله آزمایش افزوده شد. پس از آن، ۵ میلی لیتر ترکیب تازه تهیه شده استیل کلراید / متانول (v/v 1:20) به عنوان عامل استریفیکاسیون نیز به لوله های آزمایش اضافه گردید (Christie, 1981).
ج) مقداری گاز نیتروژن داخل هر یک از لوله ها تزریق شد و سپس در لوله ها محکم بسته شد.
د) لوله ها با بهره گرفتن از یک شیکر دستی هم زده و سپس به مدت یک ساعت در درون حمام آب جوش (C°۱۰۰ ) قرار داده شد. در طی این زمان، لوله ها به فاصله هر ده دقیقه از حمام آب جوش خارج و با احتیاط هم زده شد.
م) در ادامه، لوله ها سرد و به هر کدام ۵ میلی لیتر آب مقطر و ۵ میلی لیتر هگزان - افزوده شد.
ن) محتویات داخل لوله ها به مدت ۵ دقیقه با شتاب۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ و سپس محلول رویی( هگزان) به لوله های فالکون ۵۰ میلی لیتری تمیز منتقل شدند. عمل سانتریفیوژ کردن پس از افزودن ۳ میلی لیتر هگزان روی نمونه ها، دو بار دیگر نیز تکرار شد تا از انتقال کل اسیدهای چرب به همراه هگزان به لوله های جدید اطمینان حاصل شود .محتویات لوله ها از فیلتر سولفات سدیم عبور داده و به ظروف گلابی شکل از پیش وزن شده منتقل شدند. سپس، بخش حلّال به کمک دستگاه تقطیر در خلاء مدل LABOROTA4003 ساخت شرکت Heidolph آلمان در دمای ۳۵ درجه سانتی گراد و با تزریق گاز نیتروژن، جدا شد و ظروف ها مجدداً وزن شد. به این ترتیب، مقدار کل متیل استرهای اسیدهای چرب استخراج شده از هر نمونه، مشخص گردید.