۹/۲۱۹

۹/۱۹۵

۹/۱۹۶

۹/۴۵۸

جدول ۴-۲- غلظت DNA ( ng.µl^-1 ) برای ۷ رأس گاو در فصل گرم

.
۴-۲-نتایج الکتروفورزِ محصول واکنش PCRِ هر ۳ آغازگر SRY ، PLP و PARبر روی DNA ژنومی سلول­های اسپرمِ مایع منی گاو نر بر روی ژل آگارز ۲%
محصول واکنش PCR برای هر سه آغازگر SRY ،PLPو PAR بر روی DNA ژنومی اسپرم،روی ژل آگارز،الکتروفورز گردید.
همانطور که در شکل (۲-۴) مشاهده­ می­ شود،تک باند ۸۹ جفت­بازی در چاهک ۶ برای قطعه اختصاصی کروموزوم Y (آغازگر SRY ) و تک باند ۹۰ جفت­بازی در چاهک ۵ برای قطعه اختصاصی کروموزوم X (آغازگر PLP) و تک باند ۷۹ جفت­بازی در چاهک ۴ به عنوان ژن خانه­دار که روی هر دو کروموزوم X و Y قرار دارد (آغازگر PAR)،دیده­شد.
تک باند بودن وعدم وجود باند اضافی و غیر اختصاصی در هر ۳ نمونه صحّت واکنش PCR در شرایط و مقادیر تعیین شده و اختصاصی بودن آغازگرها را تأیید کرد.همچنین سه چاهک ۳،۲و۱،کنترل منفی واکنش PCR به ترتیب برای آغازگرهای SRY،PLP و PAR می­باشد که باندی در آن مشاهده نگردید و این نیز تأیید کنندهصحّت واکنش است.
Ladder DNA
(۱۰۰bp)

DNA Ladder
(۱۰۰bp)
۱ ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ ۷
شکل( ۴-۲ ): نتایج حاصل از PCR
۱-کنترل منفی برای آغازگر PAR . 2- کنترل منفی برای آغازگر PLP . 3- کنترل منفی برای آغازگر SRY . 4- باند نتیجه PCR برای آغازگر PAR (bp 79). 5- باند نتیجه PCR برای آغازگر PLP (bp 90). 6- باند نتیجه PCR برای آغازگر SRY (bp 89). 7- نشانگر DNA(100bp)
۴-۳-نتایج حاصل از Real-Time PCR
۴-۳-۱- منحنی استاندارد
همانطور که در شکل (۳-۴) مشخص است، عدد CT برای ۵ رقّت مختلف از DNA به ترتیب ۵۶/۳۲، ۰۱/۳۱، ۸۲/۳۰، ۹۴/۲۹، ۸۲/۲۸ می­باشد. هر چه غلظت کاهش یافته است، عددCT افزایش پیدا کرد.
در ضمن، اعداد فاکتورهای سنجش کیفیت با آنچه که مورد قبول است تطابق داشت:
Slop = 379/3
R² = ۹۸۹/۰
Eff% = 684/97
شکل (۴-۳) : منحنی استاندارد
برای تعیین کیفیت یک آزمایش،رسم منحنی استاندارد لازم و ضروری است.
۴-۳-۲- منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای هر ۳ آغازگر SRY ، PLP و PAR
همانطور که گفته­شد،در Real-Time PCR،اطمینان از اختصاصی بودن محصول با تعیین درجه دمای ذوب،صورت می­گیرد. محصولات تکثیرشده در دماهای متفاوتی بر اساس طول قطعه تکثیری و میزان G-C،به نقطه ذوب می­رسند
همانطور که در اشکال (۶-۴)، (۷-۴)، (۸-۴)، (۹-۴)، (۱۰-۴)، (۱۱-۴) و (۱۲-۴) مشخّص است، دمای ذوب برای ژن SRY، ۶/۸۰ بود. هم در فصل سرد و هم در فصل گرم این دما یکسان بود. در نتیجه واکنش کاملاً صحیح بوده و قطعه هدف کاملاً اختصاصی بود. برای ژن PLP، دمای ذوب در هر دو فصل ۰۷/۷۷ و برای ژن PAR، دمای ذوب در هر دو فصل۹۹/۸۱ گزارش شد که نشان­دهنده اختصاصی بودن قطعه هدف و صحّت انجام واکنش بود.
در واقع وجود تک پیک یا تک قلّه نشان­دهنده عدم وجود باند غیر اختصاصی و توالی­های پرایمر-دایمر برای واکنش PCR روی هر سه آغازگر SRY، PLP، PAR بود.
شکل( ۴-۶ ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگرSRY در فصل گرم
شکل( ۴-۷ ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر SRY در فصل سرد

شکل( ۴-۹ ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگرPLP در فصل سرد
شکل( ۴-۸ ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PLP در فصل گرم

شکل( ۴-۱۱ ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگرPARدر فصل سرد
شکل( ۴-۱۰ ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PARدر فصل گرم
۴-۳-۳- منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای هر ۳ آغازگر SRY ، PLP و PAR
شکل( ۴-۱۲ ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگرSRYدر فصل گرم
شکل( ۴-۱۳ ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگرSRYدر فصل سرد
شکل( ۴-۱۴ ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگرPLPدر فصل گرم
شکل( ۴-۱۵ ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگرPLPدر فصل سرد
شکل( ۴-۱۶ ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگرPARدر فصل گرم
شکل( ۴-۱۷ ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگرPARدر فصل سرد
۴-۳-۴- نتایج الکتروفورزِ محصولواکنش Real-Time PCRبرای هر ۳ آغازگر SRY،PLP و PAR بر روی DNA ژنومی سلول­های اسپرمِ ۷ رأس گاو در دو فصل گرم و سرد بر روی ژل آگارز ۲%
محصول واکنش Real-Time PCR برای هر سه آغازگر SRY،PLPو PAR بر روی DNA ژنومی اسپرم­،روی ژل آگارز،الکتروفورز گردید.
همانطور که در اشکال (۱۸-۴)،(۱۹-۴)،(۲۰-۴)،(۲۱-۴)،(۲۲-۴)،(۲۳-۴)مشخّص است،مشاهده تک باند و عدم وجود باند غیر اختصاصیو عدم وجود توالی پرایمر-دایمر نشانه صحّت واکنش Real-Time PCRدر شرایط و مقادیر تعیین شده و اختصاصی بودن آغازگرهابود.