۳-۷- همسانه‏سازی ژن‏هایhrpG و hrpW در ناقل‏های کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19)………….55
۳-۸- تایید همسانه‏سازی ژن‏های هدف در ناقل‏های کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)………………57
۳-۸-۱- واکنش کلونی PCR کلون‏های گزینش شده……………………………………………۵۷
۳-۸-۲- تایید همسانه‏سازی ژن‏هایhrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش هضم آنزیمی…………۵۸
۳-۸-۳- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………………………………………………………۵۹
۳-۹- همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121………………………………………………………59
۳-۱۰- تایید همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121…………………………………………….62
۳-۱۰-۱- واکنش کلونی PCR کلون‏های تشکیل شده……………………………………………۶۲
۳-۱۰-۲- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.۶۳
۳-۱۰-۳- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………….۶۴
۳-۱۱- توالی‏یابی……………………………………………………………………………..۶۵
۳-۱۱-۱- نتایج توالی‏یابی……………………………………………………………………..۶۶
۳-۱۲- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس.۶۷
۳-۱۳- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس……..۶۷
۳-۱۳-۱- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR…………………………..67
فصل چهارم: جمع‏بندی کلی و پیشنهادها
۴- جمع‏بندی کلی نتایج……………………………………………………………………….۷۰
۴-۱- پیشنهادها………………………………………………………………………………۷۱
پیوست
۵- دستورالعمل استخراج و خالص‏سازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه ۰۸۸(A*) NIGEB-……………………………………………………………………………………………………………………………………84
۵-۱- محلول‏های لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………۸۴
۵-۱-۱- مراحل استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………۸۵
۵-۱-۲- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………۸۶
۵-۱-۳- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….۸۷
۶- الکتروفورز با ژل آگارز……………………………………………………………………………………. ۸۸
۶-۱- نمای ساده از دستگاه الکتروفورز…………………………………………………………۸۸
۶-۲- ژل آگارز……………………………………………………………………………….۸۹
۶-۳- اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………….۸۹
۶-۴- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….۹۰
۶-۵- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91
۶-۶- طرز تهیه آگارز ۱%……………………………………………………………………………………………..۹۱
۷- دستورالعمل خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز…………………۹۲
۷-۱- خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92
۷-۲- خالص‏سازی قطعات DNA از ژل آگارز……………………………………………………………………………۹۳
۸- دستورالعمل تهیه باکتری‏های مستعد برای پذیرش DNA خارجی…………………………………….۹۵

۸-۱- تهیه سلول‏های مستعد E.coli……………………………………………………………………………95
۸-۲- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی………………………………………………۹۶
۸-۳- تهیه‏ی سلول‏های مستعد و انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با بهره گرفتن از روش ذوب و انجماد……………………………………………………….۹۷
۹- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α……………………………………………..۹۹
۹-۱- استخراج پلاسمید به روش دستی…………………………………………………………۹۹
۹-۲- استخراج پلاسمید با بهره گرفتن از کیت MBST (دکتر شایان)…………………………………….۱۰۱
۹-۳- روش تهیه محلول های IPTG و …………………………………………………X-Gal103
۹-۳-۱- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)…………………………………………….103
۹-۳-۲- تهیه ۵ برمو-۳ کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)………………………………۱۰۳
۱۰- تهیه مایه تلقیح و بهینه ‏سازی شرایط مایه‏زنی گیاه میزبان……………………………………………………..۱۰۳
فهرست جداول
عنوان صفحه
۱-۱- بیماریزایی فرم‏های مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات…………………………………. ۱۲
۱-۲- مشخصات آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر و شناسایی…………………………………………. ۲۹
۲-۲- برنامه Multipelex PCR با آغازگر‏های MS+/MS- و Xac01/Xac02……………………… 30
۳-۲- ترکیب محلول مادری برای واکنش Multipelex PCR جهت شناسایی باکتری……………. ۳۰
۴-۲- شیب‏ دمایی به‏کار رفته برای تعیین بهترین دمای اتصال با آنزیم Taq…………………………. 32
۵-۲- ترکیب محلول مادری برای واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………. ۳۲
۶-۲- چرخه حرارتی به‏کار ‏رفته برای تکثیر نهایی با آنزیم pfu…………………………………………. 33
۷-۲- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pGEM7zf(-))……………. 36
۸-۲- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pUC19)…………………….. 36